小鼠生殖工程学技术——8胚胎移植入输卵管


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在实验中,我们通过输卵管壁将2细胞期胚胎移植入代孕小鼠体内。与传统胚胎移植的过程相比,更简易,而且适合没有经验的实验操作员。


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◆材料


1. 假孕第一天的雌性小鼠(这天观察小鼠阴栓)


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2. 微型弹簧剪刀(5mm刀片)

3. 钳子(Pair of watchmaker's #5 forceps)

4. 动脉夹

5. 伤口缝合器(Autoclip 9mm; Clay Adams 427631) 和clip applicator (Mik-Ron Autoclip Applier; Clay Adams 427630)

blob.png→clip applicator

6. 塑料培养皿 (35mm X 10mm Cat.No.430588; CORNING)

7. 用于胚胎的移植和操作的玻璃微管





◆步骤



准备小鼠


1. 麻醉一只雌性小鼠。

2. 常规方法是取出卵巢、输卵管及部分子宫。

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3. 用动脉夹固定附着在卵巢囊上的脂肪



定位输卵管


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如下图所示,通过切割输卵管,往切口处插入微管,然后朝输卵管的壶腹部注入胚胎。


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但是,正如我们所看到的输卵管的图示(A),小鼠的输卵管呈细微而复杂的折叠式结构。而且,微管是从上方插入的,胚胎难以到达输卵管的壶腹部。

为了简化此过程,在操作前,可以通过动脉夹来改变输卵管的定位,如图(B)。

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1.   立体显微镜下观察输卵管,并使用钳子的尖端来确认输卵管伞部和壶腹部的位置,或者改变动脉夹的位置。

2.  通过改变动脉夹和小鼠的位置来定位输卵管。

      注意:因为每只小鼠的输卵管折叠形状都不一样,需要仔细观察和定位输卵管才能更容易地进行实验。
      注意:如果你是左撇子,就能轻易地完成定位输卵管的步骤。



胚胎与玻璃微管的制备

1.   在培养皿上制作一个200μL的 KSOM/AA滴液 (无液体石蜡),然后在滴液里放入20个胚胎。

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2.   制作转移胚胎的玻璃微管,管内的空气和溶液交替间隔2-3mm 。然后用玻璃微管吸入10个胚胎。


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     注意:如上图所示,当玻璃微管首次插入滴液时,液体石蜡会残留在滴液的表面。玻璃微管应从另一边吸入胚胎,以免吸入液体石蜡。


有证据表明,如果输卵管沾上液体石蜡会对胚胎发育造成不利的影响。 


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转移胚胎

1.   使用Pair of watchmaker's #5 forceps和微型弹簧剪刀,解剖伞部和壶腹部之间的输卵管壁。

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2. 将含有胚胎的微管插入输卵管的切口处,朝壶腹部注入胚胎。


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3.  用钳子固定微管插入的输卵管的位置。

4.  排出胚胎和2~3个气泡到壶腹部处。

注意: 如果实验进程顺利,你可以通过壶腹部的壁看到气泡。

  注意:如果你无法将胚胎和气泡排进输卵管,稍微往后移动玻璃微管,再次尝试。 

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5. 将切口处的微管移走。

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注意:调整输卵管的位置和方向后才能转移胚胎。如果微管平行对齐输卵管,就能更容易地插入输卵管内。 



6. 把卵巢、输卵管和子宫放回小鼠的腹部,用伤口缝合器缝合伤口。 

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7. 重复上述步骤,把剩余的10个胚胎移植到另一只小鼠的输卵管内。

8. 在37°C 加热板上保持小鼠的体温,直到小鼠苏醒。





考文献

【1】  Nakagata N. 1992. Embryo transfer through the wall of the fallopian tube in mice. Exp. Anim. 41: 387-388.

【2】  Nagy A., Gertsenstein M., Vintersten K., and Behringer R. 2003. Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual (Third edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 0-87969-591-9.





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