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MagCapture™ 外泌体提取试剂盒
MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS

新型亲和分子提取外泌体新品速递图wako.jpg

MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS



原理


       外泌体和其他细胞外囊泡(EVs)属于小细胞膜囊泡,包含蛋白,mRNA,microRNA,DNA和脂类,是由不同细胞分泌,并且在体液包括血液、唾液、尿液、脑脊髓液(CSF)和乳液中稳定存在。这些EVs被当做细胞和细胞沟通的信使,不同疾病的生物标志物。提取外泌体的常规方法有:超离,使用表面抗原的抗体进行亲和层析,和用多聚物试剂进行沉淀。然而,这些方法在回收效率,纯度和可操作性上不是非常令人满意。

       MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS采用磁珠和磷脂酰丝氨酸(PS)结合蛋白(PS亲和法)的方法进行纯化。该方法可以很方便获得高纯度的外泌体和其他来自细胞培养基和体液的EVs(通过正常的微滤方法获得高产量)。如果想要获得更高纯度的外泌体,请使用10,000×g获得上清。该试剂盒利用中性pH的金属螯合试剂,将捕获的EVs从磁珠上洗脱下来,可以获得完整的外泌体和其他EVs。纯化的完整外泌体和其他EVs可用于不同实验,包括电镜分析,纳米粒子追踪分析,EVs的操作和分析。

  细胞膜表面磷脂酰丝氨酸的亲和方法

 

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  使用磷脂酰丝氨酸(PS)结合蛋白,细胞外囊泡在金属离子依赖方式捕获,接着用金属钙离子螯合试剂进行洗脱。

  


◆优点・特色


 nezumi-1[1]-cn.jpg

 

使用新型亲和提取方法

● 通过PS亲和分子回收

● 低背景值

● 在中性条件下通过螯合试剂进行温和洗脱

※ 可获得高纯度,完整的外泌体

捕获.JPG



无需进行超离

● 使用磁珠改进了操作

● 流程优化

※ 高重复性


tokutyo-2.gif

与其他提取方法相比

方法

外囊泡纯度

囊泡状态

可操作性

回收量
PS亲和法

■■■

完整

简便稳定

■■■

超速离心法

■■

完整

简便

■■

聚合物沉淀法

完整

简便快捷

■■■■
密度梯度离心法
■■■■完整
复杂
■■

抗体亲和法

■■■

不完整

简便稳定

■■

样品类型:细胞培养上清、血清、血浆、尿液等。


● 可以纯化高纯度完整的细胞外囊泡

● 可以从细胞上清液、血清、血浆和尿液中纯化外囊泡

● 重复性高,回收量稳定

● 简易操作(约3.5小时)

● 启用多个样品(无需超速离心)


产品列表


产品名称包装规格保存条件
MagCapture™
Exosome Isolation Kit PS

10次

(产品编号:293-77601)

2次

(产品编号:299-77603)

2-10°C

试剂盒成分

(1) 链霉亲和素磁珠
(2)生物素标记的外泌体捕获
(3)外泌体捕获免疫固定缓冲液
(4)外泌体结合增强剂(×500)
(5)洗涤缓冲液
(6)外泌体洗脱缓冲液
(7)反应管

<10 次>
 600 μL×1 管
 100 μL×1 管
 35 mL×1 瓶
 500 μL×1 管
 75 mL×2 瓶
 5 mL×1 瓶
 22 管
<2 次>
 120 μL×1 管
 20 μL×1 管
 7 mL×1 瓶
 100 μL×1 管
 30 mL×2 瓶
 1 mL×1 瓶
 1 管

 *每套试剂盒能完成5次回收实验,即实际使用量为10×5次/Kit与2×5次/Kit

 


◆案例・应用


1.     从人血清中提取外泌体的产量比较

使用该试剂盒,超离和表面抗原的抗体亲和纯化的方法提取人血清样品的外泌体,接着中CD9和CD63抗体进行免疫印迹实验进行检测。


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第1道:超离

IMG_256

第2道:MagCapture™

第3道:外泌体提纯试剂盒(CD9)(公司A)

第4道:外泌体提纯试剂盒(CD63)(公司A)

第5道:外泌体提纯试剂盒(CD81)(公司A)

第6道:外泌体提纯试剂盒(CD9)(CD9,CD63,CD81&EpCAM的抗体磁珠混合物)

nezumi-2[1]-cn.jpg 

2.     常规沉淀方法的比较

来自K562(人慢性粒细胞白血病(CML))细胞培养上清(无血清培养基,或者10% 外泌体缺失FBS补充培养基)用该试剂盒、超离和多聚物沉淀方法纯化外泌体的产量和纯度比较。

 

MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS

离心(10,000 ×g ,30分钟),从1mL预处理的K562细胞培养上清(无血清培养基或者10%外泌体缺失FBS补充培养基)收集外泌体(根据试剂盒操作流程,反应时间:3小时)


超离

离心(10,000 ×g ,30分钟),10mL预处理的K562细胞培养上清(无血清培养基或者10%外泌体缺失FBS补充培养基)超离(110,000×g,70分钟)。用TBS重悬沉淀后,重新超离沉淀的片段回收。


多聚物沉淀

离心(10,000 ×g ,30分钟),从1mL预处理的K562细胞培养上清(无血清培养基或者10%外泌体缺失FBS补充培养基)收集外泌体(根据公司A的实验流程,预计时间:过夜)




2-1.  用NanoSight进行电镜显微镜分析和Nano示踪分析

       使用MagCaptureTM、超离和多聚物沉淀从K562 细胞培养上清(无血清培养基)获得的外泌体片段的颗粒大小用NanoSight LM-10进行鉴定。收集的外泌体片段(2-4 x 1010颗粒)用2%多聚甲醛进行固定,用电镜分析。

 

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2-2. K562细胞培养上清回收量和纯度的比较(无血清培养基)

        用MagCaptureTM、超离和多聚物沉淀从K562 细胞培养上清(无血清培养基)获得样品进行电泳。接着用银染,CD63, Flotilin-2和Lamp-1抗体进行免疫印迹实验。


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nezumi-4[1]-cn.jpg


 


2-3. 从K562细胞培养上清获得回收率和纯度的比较(用10% FBS-补充)

       用MagCaptureTM 、超离和多聚物沉淀三种方法,从K562 细胞培养上清(10% 外泌体-缺失 FBS补充培养基)获得样品进行电泳,用银染方法和CD63、Lamp-1和Flotilin-2抗体进行免疫印迹。同时,收集的样品也进行质谱测定,比较所有鉴定的多肽中来自K562细胞的人来源多肽的百分比(由于添加到细胞培养基的FBS中牛蛋白聚集体是混杂的,所以人来源多肽的比率会下降)


 

1214945611909239.jpg


 

3.     细胞培养上清或者血清、血浆的预处理


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4.     检测流程


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更多应用说明,请点击:

新型亲和性外泌体纯化法与外泌体高灵敏度检测应用

外泌体与肿瘤细胞转移及恶化的关联

欲了解相关产品请点击文字:

PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒(抗小鼠IgG POD)

Wako外泌体相关抗体CD63单克隆抗体

MagCaptureTM 系列用磁珠捕获磁力架

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PS亲合法

  通过使用T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白域包含蛋白4Tim4)分离高度纯化的外泌体。Tim4是在巨噬细胞上表达的I型跨膜蛋白,其强烈结合磷脂酰丝氨酸,不仅显示在凋亡细胞上,而且显示在外泌体和微泡。使用Tim4蛋白,其特异性结合显示在外泌体表面上的磷脂酰丝氨酸。因为结合是Ca2+依赖性的,完整的外泌体可以通过添加Ca2+螯合剂容易地从Tim 4释放。值得注意的是,利用PS亲和法提取的外泌体纯度之高可以用过质谱显示的。还用于从细胞条件培养基沉淀中分离大外泌体和通过ELISA、流式细胞术对外泌体的灵敏定量。这些结果表明通过Tim4蛋白纯化的有用性表征Evs的真正功能。

Wataru Nakai, Takeshi Yoshida, Diego Diez etl.A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles[J]Nature, Scientific Reports 6, Article number: 33935 (2016). doi:10.1038/srep33935



封面1.png

和光外泌体提取试剂盒宣传页

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Wako外泌体英文版说明书.pdf



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成功研发提取高纯度外泌体方法

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MagCapture™ 外泌体提取试剂盒中文说明书



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Exosome外泌体提取试剂盒.pdf






操作流程



样品制备流程(步骤1)


protocol[3]-cn.jpg



b1.jpg



外泌体捕获固定流程(步骤2)



c.jpg



亲和提取流程(步骤3—5)


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外泌体提取血浆样品前处理步骤


使用TBS缓冲液进行缓冲液交换

1、向VIVASPIN 20(100K)中添加19ml TBS缓冲液。

2、将1ml血浆添加到(步骤1)的VIVASPIN 20(100K)中并混合。

3、离心(步骤2)中的VIVASPIN 20(100K)。 (离心条件参考使用说明书)

4、当上层液体下降时,添加10ml TBS缓冲液到(步骤3)的VIVASPIN 20(100K)中。

5、离心。

6、当上层液体下降时,添加10ml TBS缓冲液到(步骤5)的VIVASPIN 20(100K)中。

7、离心。

8、当上层液体下降时,添加11ml TBS缓冲液到(步骤7)的VIVASPIN 20(100K)中。

9、离心VIVASPIN 20(100K),直到样品体积变为1ml。

该方案共计使用50ml的TBS缓冲液。



MagCaptureTM 外泌体提取试剂盒

常见问题



• 关于试剂盒的规范、性能


Q1 本试剂盒使用了抗体

A1 没有使用抗体。使用了与金属离子结合和与磷脂酰丝氨酸(PS)结合的蛋白。

 

Q2 用此款试剂盒可提取什么样胞外囊泡呢

A2 外泌体和大型细胞外囊泡(微小泡)。


Q3 外泌体和微泡的区别是?

A3 外泌体,是来源于晚期胞内体,直径为40-100nm的细胞外囊泡。微泡来源于细胞膜,直径100-1000nm的细

      胞外囊泡。

 

Q4 外泌体和微泡能可以分别纯化吗?

A4 可以。同时纯化的情况下,1200×g离心取上清液。纯化外泌体的情况下,10000×g离心取上清液。只纯化微

         泡的情况下,10000×g离心,沉淀置于TBS制成悬浊液备用。样品的前处理请参考操作说明书。

 

Q5 外壳型病毒也能回收吗?

A5 能。外壳性病毒膜表面也有PS,混入外壳性病毒的样品,所有PS都能回收。需要分离的情况下,使用本试剂盒

        回收后,需要用与病毒或者外泌体特异性抗原的抗体纯化。

 

Q6 所有的外泌体都会暴露磷脂酰丝氨酸(PS吗?

A6 尚未得到实验验证。通过分析外泌体的膜脂成分证实,有几种细胞(小鼠少突胶质细胞)来源于外泌体。因

        此,不会暴露PS。另一方面有可能存在少量PS暴露的外泌体,而此款试剂不能纯化这种外泌体。但是,使用

        该试剂纯化到的外泌体,已确认有多个外泌体标记蛋白,与以单一类型的表面标记蛋白作为抗原的传统亲和方

        法相比,以膜脂成分为抗原的该试剂能取得更多种类的外泌体。另外,虽然识别表面标记蛋白的抗体可能无法

        识别不同动物来源的抗原,但是该试剂能解决这一问题(人类、小鼠、牛等都能应用)。而且已验证了可以纯

        化超速离心时需沉淀才能回收的外泌体。

 

Q7 该试剂盒的品是什

A7 使用细胞培养上层清液、血清或尿液效果显著。如果血浆中添加了螯合剂(比如EDTA)和柠檬酸,原理上无

        法分离外泌体。若要回收,可通过超滤更换缓冲液来回收。具体步骤请看相关资料。由于肝素处理过的血浆回

        收率低,从血液样本中回收请使用血清。另外有客户成功从血浆、脑脊髓液中回收外泌体。


 

Q8 一次能回收多少外泌体

A8 根据样品的种类和数量有很大的差异,据研究所实验记录,在一次的分离中最多能回收30μg蛋白质(通过

        BCA法检测)、1-2×1010粒子(通过纳米技术检测)。(K562培养基中的莫能菌素能促进外泌体分泌,可取

        5mL培养上清液进行回收)。

        1 mL正常人混合血清能回收5×109颗粒(通过纳米技术检测)。

 

• 与传统法的比较


Q9 与超速离心法相比好处在哪?

A9 与超速离心法相比,本试剂盒能更简便、重复性好、高效地回收高纯度外泌体。也能回收超速离心法无法沉淀

        的外泌体。

 

Q10 与传统抗体亲和法相比,PS亲和的优势是什么?

A10 采用传统的抗体亲和法是用变性剂进行洗脱,此款试剂盒是在中性环境下用螯合剂来洗脱的,能完整回收外

          泌体,不会混入非特异性吸附物,能获得高纯度外泌体,提取纯度更高。传统的抗体亲和法只能特异性识别

          一种外泌体表面Marker蛋白质,而本试剂盒是特异性识别膜脂质成分,更能广泛获得外泌体。有事例表明识

          别表面Marker蛋白质抗体不能识别不同动物物种的抗原,而本试剂盒能在大范围的动物物种中运用(人,

          小鼠,牛等都有报道)。

 

Q11 与其他方法相比回收的度如何?

A11 与传统沉淀法(超速离心法、多聚物沉淀法)相比,纯度更高。与超速离心法和密度梯度离心法相结合的方

          法相比,能简便地获得同等高纯度的外泌体。(原因:采用抗体的传统亲和法是用变性剂进行洗脱,因此很

          容易混入粒子等非特异性吸附物。然而此款试剂盒是用螯合剂来洗脱的,所以难以混入非特异性吸附物。)

 

Q12 与其他方法相比回收率如何?

A12 与采用抗体的传统亲和法、超速离心法相比,能获得更高的回收率(低于聚合物沉淀法)。

 

• 关于试剂盒的操作方法、组成


Q13 操作该试剂盒耗多久

A13 (1个小时预处理样品),该试剂盒Exosome Capture 磁珠的固定需要15分钟,然后3个小时的化学反应,

           最后15分钟洗脱,总计3小时30分钟。

 

Q14 本试剂盒需要特别慎重的操作吗?

A14 Exosome Capture 固定化磁珠与样品反应后的清洗步骤中最后需要去除洗净液。完全去除后再进行提取。

          提取时在提取液中加入磁珠后,确保磁珠不发生凝集并处于悬浮状态。

 

Q15 提取液的组成有哪些?

A15 是含有1mM 的螯合剂、盐、防腐剂的Tris基础溶液。若以上成分阻碍后续分析,请使用超速离心膜

         (Sartorius公司  VivaSpin500,使用100K分子量截留,Code:VS0141)并替换合适的Buffer。

 

Q16 Exosome Capture 固定后磁珠可以循环利用吗?

A16 可以。为了能够高效回收样品中的外泌体,试剂盒可完成5次回收实验。试剂盒里的缓冲液只含5次纯化的

          量。1mL体积以上样本建议进行浓缩后再回收,纯化时可进行反复抽提,提高纯化效率。详情参考操作说

          明书。

 

Q17 Exosome Capture 固定化磁珠能保存吗?

A17 可以。洗脱出外泌体后的磁珠需再使用,用试剂盒附带的 Washing buffer 或自制的TBS冷藏保存。

 

Q18 实验要留到第二天需要做什么步骤?

A18 Exosome Capture 固定化磁珠与样品的反应步骤(反应时间3小时)可以过夜(置于4℃下)。

 

• 关于样品用量


Q19 样品纯化所需的最低量是?

A19 使用旋转器的需要500μL以上,使用离心管混合器的需要100μL。样品量更少的情况下加TBS到所需最低量后

          再使用Exosome Capture 固定化磁珠。

 

Q20 大量的样品能回收吗?

A20 可浓缩后再回收。如果样品是培养上清,可以从体积50毫升的样品中回收外泌体。离心分离预处理后,取

          50mL上清液超离浓缩至1mL(推荐Sartorius Viva Spin20 使用100K分子量截留、Code:VS2041)。无

          血清培养基和添加了10% FBS的培养基也可以收集外泌体。详情参照操作说明书。因为血清样品无法浓缩,

          最多只能用10mL的样品。但是大于1mL的血清回收率低,建议反复提纯。

 

• 关于外泌体提取后的分析


Q21 外泌体中含有什么?

A21 含有蛋白质、脂质、核酸(DNA、microRNA、mRNA)等。

 

Q22 提取后的胞外囊泡可以用什方法检测?

A22 因为能得到完整的细胞外囊泡,可以使用所有的分析方法。

         (例)蛋白质分析:蛋白质电泳、免疫印迹、质谱分析、流式细胞术、ELISA等

      核酸分析如:定量PCR、微阵列(生物芯片)、新一代测序等

      粒子分析:电镜分析,纳米位点分析(NTA)等

      功能分析:体内外的用药实验等

 

Q23 提取后的细胞外囊泡(EVs)能直接添加到细胞使用中吗?

A23 可以使用,但有需要注意的地方。如果提取液的成分有影响,参考Q15替换合适的Buffer。使用离心过滤

          部件。

         (Millipore 公司ΜLtrafree - MC, GV 0.22μm 已灭菌、Code:UFC30GV0S)除菌。

 

Q24 电镜分析需要外泌体的量是多少?

A24 能用电镜观察到2-4×1010的粒子(通过纳米技术检测)。

 

Q25 提取出的细胞外囊泡的保存条件是?

A25 冷藏、冷冻保存。长期保存需要放到-80℃。

          为避免冻结溶解,冻结保存推荐细分后保存。

 

Q26 如何做回收的外泌体提取液的免疫印迹?

A26 本公司研究所从回收的100 μL提取液抽取15 μL,加入5 μL 4×SDS样品Buffer,共20μL的样品全量上样进行

          SDS-PAGE。用量与宣传册上的免疫印迹的样本量一致。


Q27 Exosome质谱检测的步骤是?

A27 外泌体提取→SDS-PAGE与胶内酶切→通过LC-MC/MS进行蛋白质组学分析



 

• 关于外泌体标记


Q28 用该试剂盒提取出来的囊泡怎判断是外泌体呢

A28 根据表面抗原的抗体(WB)、电子显微镜、密度梯度离心、纳米粒度测量(如NanoSight LM10)等来

          验证。


Q29 外泌体分离后用免疫印迹法确标记蛋白是什么?

A29 CD9, CD63, CD81, Frotillin-2, Lamp-1等。

 

• 相关产品


Q30 有在售和光检测外泌体用的抗体

A30 本公司当前销售以下抗体。

          Anti CD9 for Exosome Isolation(Cosmo Bio Cat. NO.CAC-SHI-EXO-M01-50UL

          Anti CD81 for Exosome Isolation(Cosmo Bio Cat. NO.CAC-SHI-EXO-M03-50UL

          Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13)(Wako Cat. NO.012-27063

          Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13)(Wako Cat. NO.016-27061

 

Q31 有可以从分离囊泡里提RNA试剂

A31 有。可使用microRNA Extractor SP Kit(295-71701)比AGPC法更能高效提纯RNA。

 

Q32 售磁支架吗?

A32 有的。Wako品牌,产品编号290-35591,MagCapture系列磁珠捕获用磁力架。”

 

Q33 该技术专利是什么?

A33 已申请PCT专利。


Q34 加入什么金属离子?

A34 钙离子

 

Q35 血浆提取方法是?

A35 请查看相关资料


Q36 试剂盒中的22支反应管有什么特殊之处吗?用普通的1.5mL离心管可以吗?

A36 该试剂盒中的反应管使用特殊材质,可减少磁珠吸附,该反应管可单卖

A36 BMBio BM-15 Ring Lock Tube 1.7mL 500 tubes/box 1。



参考文献


[1] Wataru Nakai, Takeshi Yoshida, Diego Diez etl.A novel affinity-based method for the isolation 

        of highly purified extracellular vesicles[J]NATURE, Scientific Reports 6, Article number: 33935

        (2016). doi:10.1038/srep33935 全文

[2]   Genome Transfer Prevents Fragmentation and Restores Developmental Potential of

        Developmentally Compromised Postovulatory Aged Mouse Oocytes.Yamada M, Egli D.

        Stem Cell Reports. 2017 Mar 14;8(3):576-588. PMID:28242217

[3]   Developmentally Regulated RNA-binding Protein 1 (Drb1)/RNA-binding Motif Protein 45 

        (RBM45), a Nuclear-Cytoplasmic Trafficking Protein, Forms TAR DNA-binding Protein 43 

        (TDP-43)-mediated Cytoplasmic Aggregates.Mashiko T, Sakashita E, Kasashima K, Tominaga

        K, Kuroiwa K, Nozaki Y, Matsuura T, Hamamoto T, Endo H.J Biol Chem. 2016 Jul 15;291(29)

        :14996-5007. PMID: 27226551

[4]   Osawa S, Kurachi M, Yamamoto H, et al. Fibronectin on extracellular vesicles from microvascular

        endothelial cells is involved in the vesicle uptake into oligodendrocyte precursor cells[J]. Biochemical

        and Biophysical Research Communications, 2017, 488(1): 232-238.

[5]   Nagashima S, Takahashi M, Kobayashi T, et al. The characterization of the quasi-enveloped hepatitis

        E virus particles released by the cellular exosomal pathway[J]. Journal of Virology, 2017: JVI. 00822-17.

产品编号 产品名称 产品规格 产品等级 产品价格
293-77601 MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS
Exosome外泌体提取试剂盒PS 
10次用
299-77603 MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS
Exosome外泌体提取试剂盒PS
2次用 for Genetic Research  -
016-27061 Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13) 
 抗CD63单抗(3-13) 
20uL - -
012-27063 Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13) 
抗CD63单抗(3-13)
100uL - -
CAC-SHI-EXO-M02-50UL Anti CD63 for Exosome Isolation
CD63 外泌体提取抗体 
50uL - -
CAC-SHI-EXO-M01-100UL Anti CD9 for Exosome Isolation
外泌体分离抗体CD9 
100uL - -
CAC-SHI-EXO-M02-100UL Anti CD63 for Exosome Isolation
外泌体分离抗体CD63 
100uL - -
CAC-SHI-EXO-M03-100UL Anti CD81 for Exosome Isolation
外泌体分离抗体CD81 
100uL - -
CSR-SHI-EXO-K010 ExoTrap ™ Exosome Isolation Spin Column Kit, for Protein Research 
外泌体分离亲和柱套装,蛋白研究用 
kit - -
290-35591 Magnet Stand
  MagCapture系列磁珠捕获用磁力架 
1个 - -
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